2001年，参与拍摄个人第一部电视剧作品《折扇探花》，在剧中饰演沈西铭一角，并凭借该剧正式进入演艺圈。

2002年，参与拍摄张庭、任达华等主演的足球题材青春励志剧《壮志雄心》，在剧中饰演刘辉一角。

2003年，参演由蒋家骏执导，林心如、陆毅等人主演的代都市情感时装励志剧《男才女貌》，饰演赵磊。

2004年，与孙兴、崔智友合作主演由霍耀良、张敏执导的爱情题材电视剧《第101次求婚》， 在剧中饰演孙兴的弟弟郑金元；同年，参演由蒋家骏执导，黄晓明、于娜等主演的时装剧《女才男貌》，该剧于2015年4月在央视八套播出。

2005年，参演蒋家骏、钟少雄执导，林峯、陈怡蓉主演的时装爱情剧《爱情新呼吸》，在剧中饰演理查一角。

2006年，参与拍摄童蕾、郭晓冬主演的爱情悬疑电视剧《谁懂我的心》，饰演邵永康的哥哥罗一阳，该剧于2008年4月首播。

2007年，再次参演蒋家骏执导的都市情感电视剧《伤城之恋》，该剧由霍建华、秦岚等主演，于2008年在中国香港播出。

2008年，与刘之冰、孙宁等人共同主演都市励志题材电视剧《永不言退》，在剧中饰演赵博风；同年，在连谏执导的悬疑剧《生死诺言》中饰演陆天扬一角；随后参演 姚芊羽、保剑锋等人主演的都市温情励志剧《我是一棵小草》，在剧中饰演岳小梅的哥哥岳峰。

2009年，参演由何洛、罗刚联合执导，霍建华、张萌、黄觉等主演的民国破案题材电视剧《唐琅探案》。

2010年，参演由林龙, 何洛等人执导的都市情感励志剧《金枝玉叶》，在剧中饰演警察杜川，该剧于2011年8月在央视八套播出；同年，参演由张国立执导，唐国强、张国立、蒋勤勤等主演 以重庆谈判为背景拍摄的历史战争题材电视剧《中国1945之重庆风云》，饰演王龙一角。

2011年，与吴秀波、张嘉译等人共同主演医疗行业剧《心术》，在剧中饰演因医闹被医院开除后转做处理医患关系的律师谷超华，并为该剧演唱主题曲《感动》；同年，参与拍摄胡静、陈楚河主演的民国宅斗戏《笑红颜》，饰演苏明利，并演唱了该剧的片尾曲《寻花》；后与黄海冰、张萌等人共同主演建党90周年献礼剧《开天辟地》，在剧中饰演反派汪精卫一角；同年主演由李惠民执导的谍战剧《生死钟声》，在剧中饰演风度翩翩、心机缜密、崇美思想严重的反面角色瞿言白。

2012年，出演个人首部电影作品《诡爱》，该剧根据于传松的同名恐怖小说《诡爱》 改编而成，由梁婷执导，于2012年万圣节档期在中国上映；同年，参演由卢伦常和李文龙执导的都市情感励志轻喜剧《爱情面前谁怕谁》，饰演善良、正直的黎海波主管 。

2013年，主演张多福执导的“幸福三部曲”系列电视剧中的第二部《幸福在哪里》，饰演腹黑反派韩江川；同年，在林添一执导，胡静、翁虹等主演的爱情题材年代剧《泪洒女人花》中饰演高立伯一角；同年，出演古装偶像剧《王的女人》，在剧中饰演陈国大王胡亥一角，该剧是于毅自出以来接拍的第二部古装剧；同年10月，凭借战争题材电视剧《打狗棍》中二丫头一角，获得了“2013年国剧盛典观众最喜爱角色”的荣誉奖项。

2014年，与杨志刚共同主演由郭靖宇、柏杉执导的年代传奇剧《勇敢的心》，饰演赵舒城，并演唱了该剧的主题曲和片尾曲两首曲目；同年，首次接触网络剧，主演中国悬疑灵异题材网络剧《灵魂摆渡》；随后，主演由张多福执导的抗战题材电视剧《绝地枪王》在四家卫视同步播 出。

2015年，继续主演《灵魂摆渡》系列网剧的第二部《灵魂摆渡2》，并演唱同名主题曲《灵魂摆渡》以及为该剧创作片尾曲《君生吾未生》。同年，主演由常晓阳执导的都市情感剧《转身遇到你》。

2016年，主演母爱主题剧《娘道》，于毅在剧中一人分饰两角，扮演一对出生大户人家，但性格命运迥异的孪生兄弟；同年11月，主演的《灵魂摆渡》系列季播剧的最终季《灵魂摆渡3》在爱奇艺播出。

2017年5月，主演网络电影《灵魂摆渡·黄泉》。随后，参加北京卫视大型明星跨界音乐真人秀节目《跨界歌王第二季》。6月，出演李小平执导的刑侦剧《走火》，饰演严厉古怪的“师傅”赵鹏程。8月，主演电视剧《黑土热血》在央视播出。10月，参加北京卫视原创跨界喜剧现场秀《跨界喜剧王》。12月，参加浙江卫视演技竞演类励志综艺《演员的诞生》。

2018年2月，录制2018天津卫视春晚，与王珮瑜组成“双鱼组合”，演绎《当爱已成往事》。2月5日，参加真人秀综艺节目《三个院子》。2月16日，参加“2018北京台春晚”，与江珊、陈建斌、安悦溪 一起演绎跨界创新节目《我看到这城市的美》。6月，主演都市刑侦剧《走火》在浙江卫视播出。8月，参加浙江卫视“中国蓝”十周年也别企划节目《嗨！蓝朋友》。9月，主演的母爱传奇剧《娘道》在北京卫视、江苏卫视播出。9月30日，参加中央三套综合频道《欢声笑语迎国庆》，演唱《牧歌》以及胡可一起演唱《外婆的澎湖湾》两首歌曲。

2019年2月4日，参加中央广播电视总台春节联欢晚会。与扎西平措、傲日其楞一起演唱歌曲《夜空中最亮的星》。2月5日，在北京卫视2019年春晚中，与岳丽娜、张少华等表演小品《全家福》。2月19日，参加中央综合频道2019元宵晚会，与扎西平措、傲日其楞一起演唱歌曲《最美的太阳》。2月22日，参加湖南卫视声音竞技秀综艺节目《声临其境》。3月8日，以特邀嘉宾身份参加大型曲艺文化类节目《喝彩中华》。4月18日，参加中央综合频道音乐节目《回声嘹亮》。