1999年，尹启相以GOD组合正式出道。2004年同组合GOD发行第五张专辑后，宣布暂时退出组合，正式转型为演员。同年，尹启相首次出演个人首部电视剧《嫂嫂19岁》 ，在剧中他饰演了一个青春叛逆的姜承载。 随后他还主演了青春电影《芭蕾舞学院》，并凭借该片获得第41届百想艺术大赏最佳新人男演员奖。12月7日，尹启相正式入伍服役。

2006年12月6日，尹启相正式退伍。

2007年，尹启相携SBS都市爱情剧《为爱疯狂》回归演艺界，剧中他饰演飞机检修技师金采俊。

2008年，他与金荷娜搭档主演了爱情电影《六年之痒》，并在片中饰演家庭电视购物频道制作人在英。同年， 他还主演了剧情电影《野兽男孩》，片中饰演了原本单纯却逐渐迷失自己的胜宇。此外他还和高雅拉合作主演了MBC浪漫爱情喜剧《你是谁》，剧中饰演一个冷酷无情的企业家车承孝。

2009年，尹启相与李政宰、李善均合作主演了MBC水木剧《Triple》，剧中饰演性格随和的广告撰稿人张贤泰。同年还主演了剧情电影《执行者》，该片是韩国影史上首部由法务部授权可以在监狱内实拍的电影。

2010年6月，他与苏志燮、金荷娜合作主 演了MBC电视台月火剧《一号国道》，剧中尹启相饰演陆军军官学校出身的精英军官申泰昊。同年还和郑有美搭档主演了爱情电影《再靠近一点》。

2011年5月，他与车胜元、孔孝真合作主演了MBC爱情轻喜剧《最佳爱情》，剧中饰演了一位拥有完美条件的韩医院院长尹必周。同年11月，他与安内相、尹宥善等合作主演了MBC情景喜剧《high kick 3》，并凭借该作品获得2011年MBC演技大赏喜剧类男子优秀演技赏。此外由他主演的电影《丰山狗》也获得第32届青龙电影节和第48届大钟电影节最佳男演员提名。

2013年，尹启相与朴信惠搭档主演了爱情短片电影《爱的剪刀石头布》，并在片中饰演了一位平凡的上班族允哲。随后，他还与叶青合作主演了中韩合作的爱情微电影《狠爱你》。

2014年2月，他与韩智慧搭档主演了KBS月火剧《阳光满溢》，剧中饰演阴差阳错被冤枉杀人入狱，出狱后以诈骗为生的李恩修。同年10月，尹启相与高俊熙、黄灿盛合作主演的电影《红地毯》在韩国上映。同年，尹启相宣布回归GOD，并参与了GOD出道15周年纪念专辑的录制。

2015年，尹启相与韩艺璃合作主演了爱情电影《戏剧性的一夜》，并在片中饰演了正勋。同年，他和李凡秀搭档主演了JTBC电视台黑色动作剧《Last》，剧中饰演了投资失败，人生跌落谷底但凭藉敏捷的头脑和锲而不舍的耐性开始逆袭的张泰浩。

2016年，加盟tvN全新月火剧《Good Wife》，饰演法律事务所代表徐中元。10月4日，与尹汝贞合作的电影《酒神小姐》正式上映，该片获得17届意大利罗马亚洲国际电影节最佳作品奖，并受邀多个国际电影节。

2017年，与马东锡、赵在允等人共同主演影片《犯罪都市》。

2019年11月，搭档河智苑主演JTBC金土剧《巧克力》。