1996年，在濮存昕主演的反腐刑侦剧《英雄无悔》中饰演刘贵田，正式开始从事影视剧工作。1997年，出演电影《第九营》，该 片是马少骅参演的首部电影作品 。

1998年，参演唐敬睿执导的司法题材电视剧《大法官》在剧中饰演王玉和一角，该剧于2001年在央视一套首播；同年，参演由丁荫楠执导的“商海横流”三部曲中的第一部《商旗》。

1999年，与巫刚联合主演悬疑警匪剧《铁血警魂》饰演刑警队长连克勤；同年，出演由巴特尔执导，程煜、李幼斌主演的警匪剧《我是警察》。2000年，主演历史革命剧《平民大总统》，在剧中饰演“中华民国国父”孙中山，该剧以孙中山先生1912年1月1日至4月初在南京就任临时大总统的91天为主线叙述。

2001年，主演历史题材电影《风雨十二年》，首次在大荧幕上饰演孙中山，该片以孙中山和宋庆龄从1913年结识到1925年诀别的相爱过程为主要线索，以宋庆龄为主要视角描写二人的一生。2002年，参演张黎执导的近代史剧《走向共和》，在剧中再次饰演孙中山，该剧于2003年4月在央视一套首播。

2003年，主演由强小路执导的二十集人物传记题材电视剧《张大千敦煌传奇》，在剧中饰演中国国画大师张大千，该剧讲述了张大千在敦煌期间的故事；随后，在胡玫执导，陈宝国等人主演的历史正剧《汉武大帝》中饰演窦太后的侄子窦婴，该剧于2005年1月在中央电视台一套黄金档播出 。

2004年，主演以党的十六大代表、十届全国人大代表、全国优秀共产党员李连成为生活原型而创作的一部八集主旋律作品《当家人》，在剧中饰演一心一意为群众谋利益，带领群众艰苦创业、治穷致富的村党支部书记李天明。

2005年，与陶泽如共同主演由管虎执导的平实纪录式电视剧《生存之民工》，在剧中饰演一个色厉内荏、圆滑自私的老江湖，既可怜又可厌，善中有恶、恶中有善的河南民工谢老大；同年，主演反映唐太宗贞观之治时期的历史剧《贞观之治》，在剧中饰演唐太宗、唐高宗时期的宰相，深得太宗信任的长孙无忌一角；同年，在何炅主演的古装历史剧《正德演义》中饰演糖人孙；接着，参演康洪雷执导的犯罪题材剧情片《一针见血》；随后，主演由陈胜利执导的抗日题材谍战剧《喋血1941》，该剧讲述了日本侵略中国期间，关于一批黄金的斗争、国家利益、日本侵略等方面的故事。

2006年，搭档刘金山主演，由谢晓梅执导的战争喜剧《追杀横路靖六》，在剧中饰演文家村首户，乐善好施的文善仁，该剧主要讲述了1944年冀中平原的八路军与日军的斗争故事。

2007年，主演革命战争剧《浴血坚持》，饰演老一辈无产阶级革命家陈毅，马少骅为了演绎好陈毅，不善骑马的他几次从马上摔下还坚持拍摄；同年，参演公安刑侦题材剧《暗流》饰演李局长。

2008年，在主旋律题材电视剧《红灯记》中饰演一号反面人物日本军官鸠山，这是马少骅第一次饰演反面人物；同年，与赵峥共同主演年代商界传奇剧《当家大掌柜》饰演一个忠义立身、充满东方式智慧的史大掌柜肖子富；同年，在梅花党系列谍战剧《秘密列车》中饰演周明天；随后，出演宁浩执导的喜剧电影《疯狂的赛车》，在影片中饰演扮演黄渤饰演的耿浩的师父。

2009年，与李亚鹏主演抗战剧《关中枪声》，在剧中饰演一个在当时陕西学界、政界颇有影响的人物梁守道；同年，出演再次与管虎合作，主演革命剧《沂蒙》，并凭借该剧中的李忠厚一角提名第28届中国电视剧飞天奖优秀男演员；随后，在电视剧《好大一棵树》中饰演“100位新中国成立以来感动中国人物”之一的邓平寿。

2010年，主演由管虎编剧并执导的，现代都市生活题材电视剧《外乡人》，在剧中饰演脾气粗暴急躁爱算计，但是为人仗义的谢长发一角，并凭借该角色提名第25届中国电视金鹰奖最佳男演员。

2011年，主演纪念辛亥革命100周年的史诗献礼电视剧《辛亥革命》，又一次饰演孙中山，并凭借该角色提名第29届中国电视剧飞天奖优秀男演员；同年，参演由张黎、刘淼淼共同执导的展示中国崛起的坎坷与曲折的战争历史题材电视剧《圣天门口》；同年，参演由韩三平执导，为庆祝中国共产党建党九十周年而制作的献礼影片《建党伟业》，饰演首任临时大总统孙中山先生。

2013年，与于震等人共同主演抗战剧《一个鬼子都不留》，在剧中饰演山西杂耍班班主，庄继宗的结拜大哥,游击队队员，后为救庄继宗而死的李占魁一角。

2014年，在刘烨、陈宝国主演的电视剧《北平无战事》中饰演林大潍一角；同年，与张国立、陈宝国共同主演电视剧《原乡》，在剧中饰演老兵杜守正；随后与萨日娜共同主演重大革命历史题材电视剧《历史转折中的邓小平》中饰演邓小平，得到了邓小平子女的肯定，并凭借该剧获得第18届北京影视春燕奖最佳男主角奖和第21届上海电视节-白玉兰奖杰出贡献奖等荣誉。

2015年，主演丁黑执导的历史题材电视剧《冯子材》在剧中饰演清末将领、民族英雄冯子材；同年，再度与萨日娜合作出演由于荣光执导的真人真事改编的纪实片《独龙之子高德荣》。

2016年，主演由罗灿然执导的亲情励志题材电视剧《搭错车》，马少骅在剧中饰演了一位以卖破烂为生，将自己的一生都奉献给了收养的女孩阿美的哑父，该剧收视率获得全网第一的好成绩；同年，参演由李雪执导的医疗题材都市剧《外科风云》，在剧中饰演仁合医院的院长傅博文一角。

2017年，主演主旋律文艺电影《匠心》，饰演性格孤傲冷僻的著名木雕工匠陆明松。

2019年8月，参演电视剧《我们的西南联大》。9月，主演历史电视连续剧《民为天之丁宝桢》。